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4 Ergebnisse

4.8 Die F

420

-abhängige N

-Methylen-H

MPT-Dehydrogenase (KMtd) aus

M. kandleri

4.8.1 Co-Kristallisation von KMtd mit H

MPT-Derivaten und F

420

Die Co-Kristallisation von KMtd mit Substrat (H

MPT-Derivate) und Cosubstrat

420

bzw. F

) wurde in Zusammenarbeit mit Frau Ulrike Demmer (Max-Planck-Institut

für Biophysik, Frankfurt) in Sitting drop-Kristallisationsplatten unter anaeroben

Bedingungen und Rotlicht durchgeführt (siehe Abschnitt 3.6.1). Zum Einfrieren der

Proteinkristalle vor der röntgenographischen Untersuchung wurden diese mit einem

passenden Cryo-loop eingefangen, im laminaren Stickstoffstrom eingefroren und bis

zur Messung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Die Kristallisationsversuche wurden sowohl in Anwesenheit von Methylen-H

MPT

als auch Methenyl-H

MPT

sowie von F

420

bzw. F

durchgeführt, jedoch wurden nur

mit Methylen-H

MPT und F

420

Kristalle erhalten, die besser als bis zu 2 Å streuten

(siehe Abbildung 4.15). Die Kristallisationsbedingungen sind in Tabelle 4.5

aufgeführt.

Tabelle 4.5: Kristallisationsbedingungen für die Co-Kristallisation von KMtd mit

Methylen-H

MPT und F

420

Parameter Wert

Kristallisationspuffer 10 mM MES pH 5,5

5 mM Methylen-H

MPT

1 mM F

420

Proteinkonzentration 15 mg/mL

Kristallisationsmethode

sitting drop

Reservoirpuffer 100 mM MES pH 6,5

100 mM Na-Acetat

31 % PEG 400

5 mM Methylen-H

MPT

1 mM F

420

Tropfengröße 2 µL

Vorsättigung 50 % (v/v) des Reservoirpuffers

Temperatur 20 °C

1 2 ... 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 ... 143 144

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