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4 Ergebnisse

4.4 Rekombinantes des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus M. jannaschii

4.4.1 Reinigung

Des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus M. jannaschii konnte wie in Abschnitt 3.3.3

beschrieben mittels des Vektors MJmtrA3/pET22b+ als lösliches Protein in

E. coli BL21 (DE3) produziert werden (siehe SDS-Page, Abbildung 4.9).

Anschließend wurde nach Zugabe von 0,1 mM Vitamin B

12a

per

Ultraschallbehandlung aufgeschlossen und nach Abtrennen der Zellmembranen

mittels Ultrazentrifugation der Großteil der E. coli-Proteine durch Erhitzen auf 70 °C

aus der löslichen Fraktion ausgefällt (siehe SDS-Page, Abbildung 4.9).

Zur weiteren Reinigung wurde MJMtrA3 einer Anionenaustauschchromatographie

auf Q-Sepharose HP unterzogen und hierbei mit 422-443 mM NaCl (42-44 %

Puffer B) eluiert. Die bei 365 nm absorbierenden Fraktionen wurden mittels SDS-

Page untersucht (siehe Abbildung 4.9) und diejenigen, welche MJMtrA3 enthielten,

vereinigt. Nach erneuter Zugabe von 0,1 mM Vitamin B

12a

wurde zur Entfernung von

ungebundenem Cofaktor gegen Gelfiltrationspuffer dialysiert. Durch die

anschließende Gelfiltration auf Superdex 200 als letzter Reinigungsschritt konnte

weiterer ungebundener Cofaktor a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt werden (siehe Chromatogramm,

Abbildung 4.9). Die MJMtrA3 enthaltenden Fraktionen (82-90 mL) wurden vereinigt

und die Ausbeute mittels Bradford-Test auf 8 mg/L Kulturvolumen bestimmt.

Superdex 200 MJMtrA3

-5

115

135

155

175

195

0 20406080100120

Elutionvolumen/[mL]

Absorption 280 nm/[mAU]

Absorption 365 nm/[mAU]

280 nm

365 nm

Fraktionen mit

MJMtrA3

32 kDa

4 kDa

Abbildung 4.9: Gelfiltrationschromatogramm und Coomassie-gefärbte SDS-Page mit

Proben der Produktion in E. coli und Reinigung von rekombinantem M. jannaschii

des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3). MJMtrA3 wird in der Gelfiltration als einzelner Peak bei ca.

32 kDa eluiert. Der kleine Peak bei ca. 4 kDa rührt von nicht gebundenem Cofaktor Vitamin

12a

her. Auf Bahn 1 der SDS-Page befindet sich die lösliche Fraktion einer Probe der

Zellsuspension fünf Stunden nach Induktion. Auf Bahn 2 wurde der Überstand nach der

Hitzefällung eines Großteils der E. coli-Proteine aufgetragen. Auf Bahn 3 ist eine Probe von

MJMtrA3 nach der Ionenaustauschchromatographie zu sehen. Bahn 4 zeigt gereinigtes

MJMtrA3 nach der präparativen Gelfiltration. Im Laufe der Reinigung ist eine zunehmende

Anreicherung der 24 kDa-Bande von MJMtrA3 zu beobachten.

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