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3 Methoden

3.2.3 Restriktionsspaltung, Dephosophorylierung und Ligation von DNA

Zum analytischen Restriktionsverdau wurde folgende Reaktionsmischung

angesetzt:

2 µL DNA

je 0,33 µL Restriktionsenzym

1-2 µL Restriktionspuffer (Endkonzentration: 1x oder 2x)

(autoklaviert)

ad 10 µL

Für eine präparative Restriktionsspaltung wurden 20 µg Vektor-DNA mit 50 U

Restriktionsenzym und dem vom Hersteller empfohlenen Puffer in einem 50 µL-

Ansatz 4 h bei 37 °C inkubiert.

Um eine Religation der durch Restriktionsenzyme linearisierten Plasmide zu

verhindern, wurde mit Hilfe einer alkalischen Phosphatase die 5’-endständige

Phosphatgruppe hydrolysiert. Hierfür wurde der Reaktionsansatz der

Restriktionsspaltung mit 5,5 U Alkalischer Phosphatase aus Kaltwassergarnelen

(SAP) und dem mitgelierten SAP-Puffer versetzt und zunächst 1 h bei 37 °C

inkubiert, dann 20 min zur Inaktivierung der Phosphatase auf 65 °C erhitzt.

Anschließend wurden die DNA-Fragmente in einem Agarosegel elektrophoretisch

getrennt und die entsprechende Banden ausgeschnitten und gereinigt.

Zur Ligation wurden 200 ng Vektor-DNA (linearisierter pCR

-Blunt-Vektor bzw.

mit geeigneten Restriktionsenzymen verdauter pET-22b(+)- oder pACYCDuet-1-

Vektor) mit der entsprechenden Menge des einzubauenden DNA-Fragments (PCR-

Produkt mit stumpfen Enden bzw. das Zielgen enthaltendes Bruchstück mit

kompatiblen Enden) im Verhältnis 1:10, dem vom Hersteller mitgelieferten Puffer,

10 mM ATP und 3 U T4-DNA-Ligase in einem Reaktionsansatz von 30 µL gemischt.

Zunächst wurde bei 16 °C für 5 h inkubiert und anschließend die Ligase für 10 min

bei 65 °C inaktiviert. Nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über die

durchgeführten Ligationen. Die Ligation von pCR

-Blunt-Vektor mit PCR-Produkten

mit stumpfen Enden wurden nach Herstellerangaben (Invitrogen, Carlsbad, USA)

ausgeführt.

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