MTD 243-670 User Manual Page 21
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MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2
2.4.3 DNA-Konzentrationsbestimmung und Reinheitskontrolle
Die Konzentration wässriger DNA-Lösungen wurde photometrisch über die optische
Dichte (OD) bestimmt. Dazu wurde im Photometer (Uvikon 810 Photometer, Kontron
Instruments, Eching) die Absorption bei 260 nm in einer Quarzküvette der Schichtdicke
1 cm gemessen. Eine Absorption bei 260 nm von 1 gegen Wasser (OD
260) entspricht ei-
ner Konzentration von 50 µg / ml doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg / ml einzelsträngi-
ger DNA/RNA bzw. 31 µg / ml Oligonukleotiden (Sambrook et al., 1989). Um den
Reinheitsgrad der DNA-Lösung abzuschätzen, wurden zusätzlich die optischen Dichten
bei 230 nm und 280 nm bestimmt. Verunreinigung mit Protein führen zu einer verstärk-
ten Absorption bei 280 nm, Verunreinigung mit Polysacchariden zur verstärkten Ab-
sorption bei 230 nm. Für reine DNA gilt:
OD
260
: OD
280
= 1.8
OD
230
: OD
260
: OD
280
= 0.45 : 1 : 0.515
DNA-Konzentrationen von Plasmiden aus der automatisierten Präparation mit dem
BioRobot 8000 (Fa. Qiagen; siehe 2.4.7) wurden in 96er Mikrotiterplatten eluiert und im
Plattenphotometer gemessen (PowerWave X, Fa. Bio-Tek Instruments, Winooski, Vt.,
USA). Zur groben Abschätzung von DNA-Konzentrationen wurden Aliquots der DNA-
Lösungen elektrophoretisch im Agarosegel aufgetrennt und die Stärke der Banden mit
einem Marker bekannter Konzentration verglichen.
2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese wurde zur analytischen und präparativen Auftrennung
von DNA genutzt. Die Auftrennung erfolgte in horizontalen Kammern der Größe
11 cm x 6.5 cm. In TAE-Puffer wurden 0.8 %ige Agarosegele (Seakem LE Agarose, Fa.
Cambrex, Me., USA) angesetzt. Derselbe Puffer diente auch als Laufpuffer während der
Elektrophorese. Vor der Elektrophorese wurden die Proben mit 0,2 Vol. loading buffer
(Fa. Fermentas, St. Leon-Rot) versetzt, um die DNA zu beschweren und die Lauffront
während der Auftrennung sichtbar zu machen. Als Größenreferenz wurden 3 µl eines
10
- Inhaltsverzeichnis 3
- Abkürzungsverzeichnis 8
- 1 Einleitung 12
- 2 Material und Methoden 16
- 2.2 Nährmedien und Puffer 17
- 2.2.2 Medienzusätze 17
- 2.3.1 Zellanzucht 18
- 2.3.2 Stammhaltung 20
- 2.4.1 Geräte und Lösungen 20
- 20x TAE-Puffer 22
- 2.4.10 Scheren von DNA 25
- 2.5.1 Restriktion 26
- 2.5.2 Dephosphorylierung 26
- 50 µl Ansatz 27
- 70 µl Ansatz 27
- 2.5.5 Ligation 28
- 2.6.1 TOPO TA-Klonierung 28
- 4 µl Ansatz 29
- 2.7 Amplifikationen 30
- 2.8 Genbanken 33
- 2.8.1 Plasmidbanken 34
- 2.9 Sequenzierung 34
- „½-LGA“-Sequenzieransatz 35
- Stop-Mix 37
- MegaBACE-Sequenzieransatz 37
- 2.11 Lückenschluß 39
- 2.11.1 Primerwalking 39
- 2.11.2 Lückenschluß mit PCR 40
- 2.11.3 Multiplex-PCR 41
- 2.12 BLAST 42
- 2.12.1 Bidirektionaler BLAST 42
- 2.13.3 Annotation in ERGO 44
- 2.14 Kumulativer GC-Skew 46
- 3 Ergebnisse 48
- Pile-ups assemblieren 53
- Pile-ups 53
- Bsp143I 56
- 3.I.1.5 Lückenschluß 58
- 3.I.1.6 Sekundärstrukturen 58
- R. eutropha H16 werden noch 59
- 3.I.2 Sequenzanalyse 60
- 3.I.2.1 G+C-Gehalt 63
- Bu. pseudomallei K96243 65
- Bo. bronchiseptica RB50 65
- 3.I.2.3 RNA-Gene 66
- 3.I.2.5 Annotation 68
- R. eutropha (H16_B1213) 80
- R. eutropha nachge 80
- R. eutropha 81
- et al., 1974) 81
- R. eutropha um zwei weitere 81
- 3.I.4.2.1.4 Acetoin-Abbau 88
- 3.I.4.2.2.1 Cyanat-Hydratase 89
- 3.I.4.2.2.2 Formamidase 89
- 3.I.4.4 Kdp-ATPase 92
- 3.I.4.5 Begeißelung 93
- R. solanacearum, die aller 94
- 5 7 8 9 10 11 126 13 14 96
- 3.I.4.6.2 Potentielle Toxine 97
- 3.I.4.6.2.1 RTX-Toxine 97
- 3.I.4.6.2.2 Tc-Toxine 99
- eutropha iden 100
- 3.II.1.1 Strategieanpassung 101
- 3.II.1.2 Rohsequenzierung 102
- Anzahl der Sequenzläufe 103
- Sequenzlücken 103
- 3.II.1.4 Lückenschluß 104
- 3.II.2 Sequenzanalyse 106
- Deletion 107
- Gene der Methanogenese 108
- Hoch-exprimierte Gene 108
- RNA-Gene 108
- Skalierung 108
- (1998) 110
- ERGEBNISSE KAPITEL 3 111
- Methanogenese 113
- Methanol + H 113
- Msp. stadtmanae 115
- Mth. thermautotrophicus 115
- 3.II.4 CO 117
- -Reduktionsweg 117
- 3.II.5 Genomvergleiche 121
- GKxxxKxNGRT MKNK 129
- DISKUSSION KAPITEL 4 136
- R. eutropha H16 141
- R. eutropha JMP134 141
- R. solanacearum GMI1000 141
- R. metallidurans CH34 141
- R. eutropha H16 C. necator N1 143
- 4.I.10 Ausblick 144
- 4.II.3 Kommensalismus 147
- 4.II.3.1 Zellwandsynthese 148
- 4.II.3.2 Überlange ORFs 150
- 4.II.5 Ausblick 154
- ZUSAMMENFASSUNG KAPITEL 5 155
- Burkholderiaceae 155
- Msp. stadtmanae-spezifischer 157
- 6 Literaturverzeichnis 158
- Lebenslauf 186
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