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4 Material und Methoden

4.9.8 Klonierung von PCR-Produkten, Restriktion und Ligation von

DNA

Die Klonierungen von PCR-Fragmenten erfolgte nach Herstellerangaben (TOPO TA

Cloning, Invitrogen, Karlsruhe bzw. pGM

-T Vector System I, Promega, Mannheim).

DNA wurde ebenfalls nach Herstellerangaben mit Restriktionsendonukleasen (New

England BioLabs, Frankfurt am Main) behandelt und DNA-Fragmente nach

Sambrook und Russell (2001) mittels einer T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics,

Mannheim) ligiert.

4.9.9 Elution von DNA aus Agarosegelen

Größere DNA-Mengen wurden durch Elektroelution (Ausubel et al., 1996) aus

Agarosegelen extrahiert. Die zu eluierende DNA wurde aus dem Gel ausgeschnitten,

in einen Dialyseschlauch (Dialysis-Membrane Typ 8, cut-off:12-16 kD, pore size 25A,

Biomol, Hamburg) überführt und mit wenig Wasser überschichtet. Der Schlauch

wurde dann in eine Elektrophoresekammer mit 40 mM Tris/Acetat, pH 8,0, 1 mM

EDTA, gegeben und die DNA für 30 min bei 100 V eluiert. Nach kurzem Umpolen der

Spannung erfolgte die Fällung der DNA und der Niederschlag wurde anschließend in

10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA aufgenommen. Die Isolation kleinere DNA-

Mengen aus Agarosegelen über Anionentauscher wurde nach Angaben der

Hersteller (Perfectprep

Gel Cleanup Kit, Eppendorf, Hamburg und QIAquick Gel

Extraction Kit, Qiagen, Hilden) durchgeführt.

4.9.10 Sequenzierung von DNA

Die Sequenzierung von DNA erfolgte nach der Didesoxynukleotid-Methode (Sanger

et al., 1977). Die dafür verwendeten Oligonukleotide (MWG Biotech AG, Ebersberg)

waren mit dem Infrarotfarbstoff IRD-800 markiert. Die Sequenzreaktion wurde mit

dem Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit

(Amersham Biosciences, Freiburg) durchgeführt. Für eine Reaktion wurden 1 pmol

DNA und 2 pmol des markierten Primers mit Wasser auf ein Volumen von 13 µl

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